Virus Identifizieren

Zur Aufklärung einer Virologie dienen Virologie-Diagnostika (oder Virusdiagnostika). In den frühen Stadien der Ansteckung erfolgt zunächst der Antigennachweis (d.h. die Detektion einzelner Proteine des Virus) oder der Genomnachweis (d.h. der Erbgutnachweis). In fortgeschrittenem Stadium der Krankheit kann dann auch der Antikörpernachweis (d.h. der spezifische Antikörpernachweis der erkrankten Person gegen das Virus) erfolgen.

In der Frühphase ist der Antikörpernachweis der Immunglobulinklasse M (IgM) und später der Antikörpernachweis der Immunglobulinklasse G (IgG) sinnvoll. Einige Virusinfektionen können auch den Einsatz von Immunglobulin Klasse A (IgA) erfordern. In der Regel ist der Befund jedoch erst nach der Diagnoselücke möglich.

Die Reihenfolge der oben erwähnten Untersuchung folgt bei einer großen Anzahl von virologischen Krankheitserregern einem mehr oder weniger vorher festgelegten Schema, der so genannte Stufendiagnose. Anhand des Beispiels der HCV ( "Hepatitis-C-Infektion") wird die Schritt-für-Schritt-Diagnose erörtert. In einem ersten Arbeitsschritt wird das Patientenblut mittels eines Bluttests auf Antibiotika gegen HCV getestet.

Können keine Antikoerper festgestellt werden, kann davon ausgegangen werden, dass der Betroffene keine HCV-Infektionen erlitten hat. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass sich der Betroffene im Frühstadium einer Ansteckung befand und noch keine Antigene gegen das Virus entstanden sind. Für jeden Antikörpernachweis gegen das Virus wird das Resultat in einem weiteren Versuch (Bestätigungstest) bestätigt.

Wenn in diesem Testverfahren auch Antikörper gegen das Virus gefunden werden, kann davon ausgegangen werden, dass der Betroffene eine Entzündung mit HCV hat oder hatte. PCR (als direkte Pathogendetektion und zur Ermittlung der Virusbelastung und der damit verbundenen Infektivität des Patienten) und Virustypisierung (zur Ermittlung des Virussubtyps ) werden zur weiteren Klärung der Erkrankung eingesetzt.

Die Virusisolation ist immer dann sinnvoll, wenn sehr wenig Virusantigen im Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden kann oder wenn ein neuer Virus genauer zu charakterisieren ist. Dazu wird das Patientensubstrat auf eine Zellkultur gelegt, wenn für das betroffene Virus ein Zellkultur-Modell vorlag. Dann befallen die im Stoff vorhandenen Bakterien diese und vermehren sich.

Manche Erreger müssen durch Ultra-Zentrifugation angereichert werden. Tritt eine Entzündung auf, können bei einigen Virusinfektionen Änderungen in der Zellmorphologie (zytopathischer Einfluss, CPE) festgestellt werden. Eine zytopathische Wirkung haben jedoch nur einige wenige Erreger ( "CPE") oder es gibt keine infizierten Gewebe.

Für weitere Diagnostik können die mit einem CPE oder dem Kulturmediumüberstand dieser Zelle belegten Zelltypen wiederverwendet werden. Die Plaque-Assays haben gegenüber der PCR den großen Nachteil, dass die unmittelbare Wirkung eines Virus erkannt werden kann, da sich nur funktionelle Erreger vervielfältigen und Ablagerungen auslösen. Aus diesem Grund wird die schnelle Variante in der Regel von einer Zellkultivierung gefolgt (siehe auch PCR).

In großen Mengen im Material des Patienten vorhandene Erreger können nach Fixation und Kontrast (mit Osmiumtetroxid, Wolframphosphorsäure oder Uranylacetat) unter dem Elektronenmikroskop beobachtet werden. Diese Ermittlung ist vom Probematerial, der Verarbeitung, der Magnetfokussierung und der Bildqualität der generierten Aufnahmen abhaengig und wird daher von geschultem Personal durchgefuehrt. Eine Differenzierung von Virus-Subtypen oder Bakterien-Subtypen ist nur mit Antikörper möglich, die vorher mit kolloidalen Goldmarkierungen (Immunogoldfärbung) gekennzeichnet wurden.

Sie werden in großer Anzahl im Hocker abgesondert. Bei dieser Methode werden die Virusproteine durch markierte Virus-spezifische Antikörper bindet. Für Erreger, die Atembeschwerden verursachen, können solche Untersuchungen auch an Abstrichmaterialien oder ähnlichen Stoffen vorgenommen werden. Die angereicherten Präparate (siehe Virusisolierung) können auch als Ausgangsstoff für diesen Versuch verwendet werden.

Virenproteine können im Westblot mit Hilfe von Antigenen, die ununterbrochene epitopische Strukturen nachweisen. Im Immuntest werden Virusproteine durch das Binden von Fluoreszenz markierten Antigenen in einer festen Kultur mit einem Fluoreszenz Mikroskop detektiert, sofern das Injektor nicht durch denaturierte bzw. formylierte Antigene während der Fixation verdeckt wird oder ein Antikoerper gegen feste Injektoren vorhanden ist.

Die indirekte Immunperoxidase (IPA) arbeitet wie die IFT, jedoch werden die Vitamine über ein Reporter-Enzym (Meerrettichperoxidase) anstelle der Markierung durch Fluoreszenz nachgewiesen. Zur Detektion von Erregern wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Ein weiterer Arbeitsschritt ist bei einem Virus mit RNA-Genom vor dem Detektieren durch PCR vonnöten.

PCR oder RT-PCR ist für nahezu alle pathogenen Humanviren eingerichtet. Sie wird verwendet, wenn andere Nachweismethoden kein gutes Resultat bringen, aber ein dringlicher Hinweis auf eine Virusinfektion vorliegt (siehe oben), um Genomäquivalente zu prognostischen Zwecken, zur Therapieüberwachung oder wenn keine anderen Verfahren zur Anwendung kommen. Der direkte Infektionsnachweis erfolgt in der Regel mittels Zellkulturen, da die PCR nicht zwischen Viruspartikeln und Infektionsviren unterscheiden kann.

Das ist jedoch für die genaue Bestimmung ausschlaggebend, nicht aber für den Qualitätsnachweis. Durch DNA-Sequenzierung kann die DNA-Sequenz identifiziert werden, zum Teil auch im Durchsatz. Bei den Nucleinsäuren gibt es zum Teil kaum Ähnlichkeiten, weshalb ein leicht modifiziertes Virus bei konventionellen Prüfverfahren nicht merklich ist. Bereits wenige Tage nach der Ansteckung können mit Hilfe der Hochdurchsatz-Genomsequenzierung vollständig neue Erreger identifiziert werden.

Bis zu 1,6 Mio. Bases werden simultan auf einem Blutplättchen erkannt. Ein Teil davon entspricht der genetischen Information des Virus. Sowohl die bekannten als auch die schwer modifizierten oder unbekannten Krankheitserreger können in der Klinik nachgewiesen werden. Die Detektion von gegen Viruserreger gerichteten Antigenen ist nur ein eingeschränkter Beweis für eine Akutsinfektion.

Die Detektion von Antikörpern der Kategorie G (IgG) ist ein Indiz für eine frühere Erkrankung. Die Detektion von IgM Antikörpern kann ein Indiz für eine akut auftretende Erkrankung sein, aber auch nach der Akutphase kann die ASR in vielen Virusinfektionen der Kategorie M nachgewiesen werden. Für eine Beurteilung des Stadiums der Entzündung müssen zwei Stichproben im Intervall von wenigen Tagen durchleuchtet werden.

Eine Erhöhung der Antikörper-Konzentration oder eine Erhöhung des Titers kann als Indiz für eine erneute oder wiederholte Entzündung erachtet werden. Die Hemmung der Hämagglutination (HHT oder HIT) wird nur bei solchen Virusinfektionen eingesetzt, deren Oberflächenprotein in der Lage ist, Rötungen der Hämagglutination zu bindet. Bei der HHT wird das zu untersuchende Humanserum dem aus Oberflächen-Proteinen des Virus und roten Blutkörperchen bestehenden Komplettsystem hinzugefügt.

Gegen das Virus gerichtete Antikoerper hemmen die Bindung an die Oberflaechenproteine der Erreger. Neutralisationstests (NT) dienen der Bestimmung von Antikörpern aus Patienten-Seren, die eine Schutzwirkung haben. Diese sind in der Lage, die Ansteckung der Zellen mit dem Virus zu unterdrücken. Dabei ist zu beachten, dass insbesondere bei Virusinfektionen die Zellimmunantwort eine ausschlaggebende Funktion hat, denn wenn die Virusinfektion in die Zellwand eindringt, hat die Humoralimmunantwort nur eine begrenzte Aussagekraft für die Neutralisierung der Virusinfektion.

Zur Diagnose einer Akutinfektion sind daher zwei aufeinanderfolgende Seren ( "Intervall 5-10 Tage") erforderlich, in denen bei einer Akutinfektion ein vermehrter KBR-Titer bestimmt werden kann. Ausgangsstoff für den IFT-Test sind in der Regel virusinfizierte Eizellen. Die ungebundenen Abwehrstoffe werden durch Waschen abgetrennt und die Zelle mit einem zweiten Antiköper bebrütet.

Er ist mit einem Fluorchrom etikettiert. Die IFT wird für Patientenantikörper gegen viele verschiedene Virusarten eingesetzt. Die indirekte Immunperoxidase (IPA) arbeitet ähnlich wie die IFT, jedoch wird die Detektion der Immunkörper über ein Reporter-Enzym (Meerrettich-Peroxidase) anstelle der Markierung durch Fluoreszenz durchgeführt. Es ermöglicht den gleichzeitigen Antikörpernachweis gegen mehrere Virusproteine.

Dr. Otto A. Haller, Thomas Mertens (Hrsg.): Diagnose und Behandlung von Viruserkrankungen.